Enzim-Enzim Pada Proses Rekombinasi

ENZIM-ENZIM PADA PROSES REKOMBINASI
Pertanyaan
1.Proses rekombinasi di katalisis oleh enzim yang di kode oleh gen recA, recB, dan recC. Jelaskan mekanismenya!
2.Jelaskan peranan enzim integrase pada genom E. coli melaluai rekombinasi!
Jawaban 1
Protein recA merupakan suatu enzim yang berperan dalam rekombinasi umum (lazim) maupun pada perbaikan DNA. Gen recA memaang dibutuhkan untuk peristiwa rekombinasi umum pada E. coli. Pada kondisi in vitro protein tersebut yang telah dimurnikan mengkatalisasi (membantu) pembentukan struktur Holliday. Dalam hal ini protein-protein recA berikatan pada molekul DNA unting ganda maupun unting tunggal. Protein-protein tersebut juga menggunakan energi yang diperoleh dari hidrolisis ATP untuk membuka DNA unting ganda , sehingga memungkinkan terjadinya perpasangan dengan suatu DNA unting tunggal yang memungkinkan terjadinya sinapsis molekul DNA yang memiliki urut-urutan pasangan nukleotida yang mirip. Proten recA juga mengkatalisasi suatu transfer unting berikutnya sehingga terbentuk suatu jembatan silang (struktur holliday) yang selanjutnya diikuti dengan migrasi jembatan silang tadi. Bentuk serupa angka delapan itu merupakan perantara pada rekombinasi yang dikatalisasi oleh protein recA antara molekul-molekul plasmid. Bentukan angka delapan tadi sebaliknya ditemukan pada DNA yang berasal dari sel-sel E. coli yang memiliki gen recB atau recC. Oleh karena itu disimpulkan bahwa produk ke dua gen ini baru bekerja setelah protein recA bekerja. Gen recB+ dan recC+ mengkode dua sub unit suatu nuklease yang tergantung ATP. Nuklease itu berperan sebagai suatu “resolvase” yang memotong jembatan silang pada struktur holliday untuk menyempurnakan proses rekombinasi.
Protein recA juga memegang suatu peran utama pada perbaikan DNA. Fungsi perbaikan ini diaktivasi oleh DNA unting tunggal. Protein recA memiliki suatu aktivasi proteolitik yang distimulasi oleh DNA unting tunggal. Aktivitas proteolitik ini memotong sekurang-kurangnya dua macam molekul reseptor. Salah satu molekul reseptor itu adalah resepror profag lamda, yang menyebabkan induksi profag. Molekul reseptor lain adalah suatu produk dari gen lex A yang mengatur tingkat ekspresi gen recA maupun sejumlah gen yang terlibat pada mekanisme perbaikan DNA serta fungsi survival. Dalam keadaan normal reseptor lex A hanya mengkondisikan ekspresi gen recA pada tingkat rendah, tetapi menghasilkan cukup protein recA yang dibutuhkan pada rekombinasi umum. Bilamana sel terancam mengalami kerusakan DNA maka aktivitas proteolitik protein recA diaktivasi menghasilkan reseptor lex A. produksi protein recA yang meningkat juga membantu pemulihan sel, mungkin dengan cara memperantarai perbaikan oleh rekombinasi antara daerah yang rusak dan tidak rusak dari molekul DNA turunan pasca replikasi. Kompleks kedua enzim itu (recBC), memunculkan DNA unting tunggal yang mempunyai suatu ujung bebas dan kondisi nilai yang mendorong enzim recA mulai melaksanakan reaksi perpasangan.
Enzim recBC mulai melakukan pembukaan lilitan hanya pada DNA yang mengandung suatu ujung dupleks yang bebas. Enzim recBC memanfaatkan energi ATP untuk bergerak sepanjang dupleks, sambil membuka lilitan DNA maupun melilitkannya kembali. Selama pergerakan itu selalu ada segmen DNA yang terbuka, karena kecepatan pembukaan lilitan DNA lebih tinggi dibandingkan kecepatan pelilitan DNA kembali.
Aktivitas kedua dari recBC (aktivitas nuklease) yang berfungsi selama enzim tersebut membuka lilitan DNA sangat penting fungsinya bagi rekombinasi. Enzim recBC paling sering mendorong terjadinya rekombinasi pada DNA yang mengandung suatu tapak yang disebut sebagai Chi (mempunyai urut-urutan 5’-GTCGGTGG-3’). Pada DNA yang sedang terbuka lilitannya, suatu aktivitas nuclease spesifik dari enzim recBC memotong unting tunggal DNA di dekat tapak Chi yang sedang terbuka. Terputusnya DNA itu menyebabkan unting tunggal DNA tidak melilit kembali pada saat enzim recBC bergerak menyusuri molekul DNA. Sebagai akibatnya terbentuklah suatu untaian unting tunggal berujung bebas maupun suatu celah dan justru pada celah serta pada ujung bebas unting tunggal DNA itulah kemudian enzin recA berikatan dan mulai mendorong terjadinya pertukaran unting DNA dengan suatu urut-urutan yang homolog.
Jawaban 2
Fag λ mengkode enzim integrase yang berperan pada saat insersi DNA fag ke dalam genom E.coli. Insersi tersebut terjadi melalui rekombinasi pada tapak-tapak spesifik di kedua genom DNA dan hasil insersi melalui rekombinasi itu adalah terbentuknya satu molekul sirkuler baru yang lebih besar. Enzim tersebut dapat berperan pada proses penggabungan yang pada akhirnya berakibat terbentuknya dua molekul DNA yang terpisah-pisah.
Enzim integrase pada kenyataannya dapat berperan sebagai suatu enzim topoisomerase. Dalam hal ini enzim integrase membuat suatu pemutusan dalam posisi menyamping (tidak berhadap-hadapan); jarak antara kedua tempat yang terpotong adalah sejauh 7 nukleotida. Pemutusan unting DNA ini terjadi pada tapak attP maupun tapak attB.


BEBERAPA HAL SPESIFIK TENTANG REKOMBINASI
Pertanyaan
1.Bagaimanakah kejadian rekombinasi yang melibatkan dua tapak pada suatu molekul DNA yang sama?
2.Jelaskan mekanisme rekombinasi dalammemperbaiki molekul DNA yang rusak ?
Jawaban 1
Rekombinasi yang melibatkan dua tapak pada suatu molekul DNA yang sama akan berakibat terlepasnya segmen antara atau terjadinya inversi segmen antara terebut. Sel memang kadang-kadang memanfaatkan inversi hasil rekombinasi tersebut dalam rangka memilih antara kedua susunan DNA yang memungkinkan dua protein atau perangkat protin untuk diekspresikan. Mekanisme ini sering mengatur protein yang tampak pada bagian luar makhluk hidup. Contohnya antara lain protein ekor dari Mu (mutator) fag, yang diatur oleh segmen gin yang tidak dapat dibalik, serta antigen flagel dari bakteri Salmonella. Variasi fase Salmonella merupakan akibat dari ekspresi dua protein flagel yaitu H1 dan H2 yang terjadi bergantian. Dalam hal ini pada waktu tertentu, suatu sel mengekspresikan salah satu protein flagel itu, tidak pernah kedua protein flagel itu diekspresikan sekaligus. Prometer untuk gen H2 terletak pada suatu segmen DNA yang dapat mengalami pembalikan di dekatnya seukuran 970 pasang nukleotida, dan diikat oleh urutan berulang seukuran 14 pasang nukleotida dalam arah (orientasi) berlawanan. Apabila segmen DNA (yang mengandungprometer) itu mengarah dalam arah yangsama, maka letak promoter adalah di samping gen H2¬. Dalam kondisi yang seperti ini maka gen H2 ditranskripsikan dan demikian pula suatu gen lain di dekatnya yang mengkode suatu protein reseptor dari gen pengkode proteinflagel H1 yang letaknya jauh. Dapat dilihat bahwa kerja dari gen H1 dihalangi, sedangkan gn H2 justru ditranskripsikan. Di lain pihak jika segmen tadi mengalami pembalikan, maka gen H2 tidak ditranskripsika lagi(karena tidak ada prometer) dan gen pengkode protein represor untuk gen H1 juga tidak ditranskripsikan. Oleh karena itu protein H1 dibentuk. Berkenaan dengan mekanisme tersebut, segmen yang mengandung promoter tersebut juga mengkode enzim Hin yang mengkatalisasi inversi.
Jawaban 2
Seringkali berpendapat bahwa peristiwa pindah silang merupakan suatu mekanisme yang menimbulkan keanekaragaman genetik, seolah tidak ada fungsi lain. Dewasa ini diduga bahwa fungsi yang paling vital dari peristiwa pindah silang mungkin justru untuk memperbaiki kerusakan DNA. Petunjuk mengenai fungsi ini mulai terungkap pada penelitian yang terkait dengan bakteri recA serta mutan detektifv rekombinasi dari khamir. Seperti diketahui mutan-mutan tersebut sangat mudah mati akibat radiasi maupun akibat pengaruh berbagai zat kimia yang merusakan DNA. Peristiwa rekombinasi berawal dari upaya penutupan suatu celah pada molekul DNA. Dalam hal ini celah diisi oleh DNA yang berasal dari salah satu unting pasanagan homolog. Perbaikan tetap terjadi tidak tergantung kepada suatu kondisi yang mana apa perantara itu dipotong untuk menukar lengan samping dari kedua helix. Apabila ada cacat pada molekul DNA misalnya ada timen dimer, maka celah tersebut akan terbentuk kembali ketika replikasi terhenti pada tapak yang menggandeng cacat tadi; dan replikasi baru dimulai lagi beberapa saat setelah itu. Informasi genetik pada tempat cacat hilang dari kedua unting DNA dan dapat dibetulkan/dipulihkan hanya melalui/ dengan cara membuangnya melalui rekombinasi dari suatu duplex homolog.